細胞侵襲實驗目的:研究趨化因子或其他營養物質對細胞侵襲的影響。
一、準備實驗以及包被
從冰箱中取出Assembling tool 以及 CIM plate 上板。拆開上板,可見板上和蓋子上均有藍點標記,把板放在 Assembling tool 上。
1、首先進行 Matrigel 包被,每孔內加入 50 µl matrigel ,每做完一個梯度,即 4 個孔后, 馬上從孔內輕輕吸出 30µl Matrigel。
2、空白對照的四個孔同樣加入 50µl 的無血清培養基,然后吸出 30µl。
3、蓋上蓋子,將整個 Assambling tool 連同板子 ,放入培養箱中孵育 4-5 小時,使 Matrigel凝結。
二、組裝 RTCA CIM Plate-16 以及測量 CI 背景值
1、取出CIM plate 下板,放在 Assambling tool 第二個槽內,下板中加入160µl 預溫好的完全培養基。將 CIM-Plate 16 Assembly Tool 旋轉 90 度,將上板拿起,水平移到下板上方,檢查安裝是否緊扣在一起。
2、在上板中每孔加入 30 µl 無血清培養基,蓋上上板蓋子將整塊 CIM-Plate 16 放入 RTCA DP 分析儀。放在培養箱中平衡一個小時。
3、一小時后,進入 schedule 頁面,點擊開始按鈕。背景值測完后,顯示 ready for starting next step.回到Message 頁面,看是否有任何報錯信息。
三、準備細胞,并加入 RTCA CIM Plate-16 上腔
1、取出CIM plate,重新放回到超凈臺中的 Assambling tool 上,每孔加入 100 微升含 20000 個細胞的細胞懸液。
2、為了避免培養箱內由于溫差產生蒸騰作用而引起邊緣效應,將 CIM 培養板,在常溫下靜置半個小時。
四、運行實驗
將 CIM plate 重新放回RTCA DP 分析儀上,看到提示 plate scanned, connection is OK 后,點擊開始第二步。這時機器開始每 15 分鐘檢測一次孔內細胞的遷移的情況。
五、實驗結果分析
在 Cell Plot 頁面,選擇顯示平均值以及標準差,點擊 add ,可見不同組得到的實驗信號。當 Matrigel 濃度較大時,細胞侵襲越困難,而無血清培養基對照孔內,細胞侵襲的信號就非常明顯。根據包被 Matrigel 的濃度由高到低,細胞侵襲能力逐漸增強。